細胞凍存是將細胞儲存在低溫環(huán)境中，減少細胞代謝，實現(xiàn)長期儲存的一種技術(shù)。在大多數(shù)細胞系中，細胞會隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的“培養(yǎng)漂移”，在凍存過程中，適當?shù)牟僮骱秃线m的凍存條件可以減少細胞特性的改變或丟失，起到細胞保種的作用。

　　細胞凍存的前期工作有哪些

　　正確的培養(yǎng)和溫和的細胞收集

　　在凍存前，細胞應(yīng)保持最佳的生長狀態(tài)(處于對數(shù)期或指數(shù)期)，理想情況下，培養(yǎng)基應(yīng)在收獲前24h更換。建議對培養(yǎng)物進行微生物污染物檢測，特別是支原體，確保細胞沒有任何的污染。在細胞的收集過程中，實驗操作要盡可能的溫和，避免細胞受損。

　　適當?shù)牡蜏乇Ｗo劑

　　目前，細胞凍存常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞，減少在冷凍過程中對細胞的損害。細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存，細胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。

　　聚乙烯基吡咯烷酮、乙二醇、甲醇和甲基乙酰胺等都是低溫保護劑。在細胞凍存中最常見的是二甲基亞砜(DMSO)和甘油，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，關(guān)鍵在于對細胞無明顯毒性。DMSO通常濃度為5 - 10% (v/v)，最佳濃度隨細胞系的不同而不同。甘油在冷凍介質(zhì)中的最終濃度為5 - 15%，同樣，最佳濃度取決于細胞系。為了提高較難保存的細胞的存活率，凍存時可以選擇增加保存液中的血清濃度。想要凍存細胞更快更穩(wěn)，細胞凍存液會是不錯的選擇，無需配制，直接在細胞中加入適量的凍存液即可，操作簡單，就能擁有高活率的細胞。

　　緩慢的凍存速度

　　慢速凍存對細胞活力的恢復(fù)是非常重要的。對大多數(shù)動物細胞，每分鐘降低-1到-3℃能讓細胞更好適應(yīng)凍存狀態(tài)。目前大多數(shù)實驗室常用的方法是梯度降溫法：在4℃放置30 min，再轉(zhuǎn)入-20℃存放 2h，接著轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷凍過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存。一款可重復(fù)使用的細胞凍存盒，可省去多次反復(fù)轉(zhuǎn)移細胞的時間，將準備好的細胞凍存管放進凍存盒，直接在-80℃過夜后就可以轉(zhuǎn)移至液氮罐中。無論使用哪種凍存方法，重要的是在轉(zhuǎn)移存放位置的過程中一定要迅速，轉(zhuǎn)移時建議將凍存管放在干冰中恒溫，盡量避免轉(zhuǎn)移過程因溫度變化對細胞活力的影響。

　　持續(xù)的低溫儲存

　　細胞溫度應(yīng)始終保持在-130℃以下，才能達到最佳存活率。如果存放溫度控制不好，存活率會隨著時間的推移而降低。建議將細胞在液氮條件下長期保存，需要定期人工檢查液氮罐的密閉性和液氮量是否充足，避免因儲存條件造成細胞的損毀。